题目

10．（14 分）甲型流感病毒为 RNA 病毒，易引起流感大规模流行。我国科学家在 2017 年发明了一种制备该病毒活疫苗的新方法，主要环节如下。（1）改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力。以病毒 RNA 为模板，逆转录成对应 DNA 后，利用PCR技术扩增，并将其中某些基因（不包括表面抗原基因）内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列。与改造前的基因相比，改造后的基因表达时不能合成完整长度的多肽，因此不能产生子代病毒。将该改造基因、表面抗原等其他基因分别构建重组质粒，并保存。（2）构建适合改造病毒增殖的转基因宿主细胞。设计合成一种特殊 tRNA 的基因，其产物的反密码子能与（1）中的终止密码子配对结合，并可携带一个非天然氨基酸（Uaa）。将该基因与 载体连接后导入宿主细胞。提取宿主细胞的总RNA进行分子杂交鉴定，筛选获得成功表达上述 tRNA 的转基因宿主细胞。（3）利用转基因宿主细胞制备疫苗。将（1）中的重组质粒导入（2）中的转基因宿主细胞，并在补加非天然氨基酸的培养基中进行培养，则该宿主细胞能利用上述特殊tRNA，翻译出改造病毒基因的完整蛋白，产生大量子代病毒，用于制备疫苗。特殊 tRNA 基因转录时，识别其启动子的酶是D（单选）。A．病毒的 DNA 聚合酶 B．宿主的 DNA 聚合酶C．病毒的 RNA 聚合酶 D．宿主的 RNA 聚合酶（4）上述子代病毒不能在正常宿主细胞中增殖，没有致病性，因此不经灭活或减毒即可制成疫苗。与不具侵染性的流感病毒灭活疫苗相比，该病毒活疫苗的优势之一是可引起细胞免疫，增强免疫保护效果。【专题】41：正推法；548：基因工程．【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用 PCR 技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的 DNA 是否插入目的基因﹣﹣DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了 mRNA﹣﹣分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质﹣﹣抗原﹣抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

10．（14 分）甲型流感病毒为 RNA 病毒，易引起流感大规模流行。我国科学家在 2017 年发明了一种制备该病毒活疫苗的新方法，主要环节如下。（1）改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力。以病毒 RNA 为模板，逆转录成对应 DNA 后，利用PCR技术扩增，并将其中某些基因（不包括表面抗原基因）内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列。与改造前的基因相比，改造后的基因表达时不能合成完整长度的多肽，因此不能产生子代病毒。将该改造基因、表面抗原等其他基因分别构建重组质粒，并保存。（2）构建适合改造病毒增殖的转基因宿主细胞。设计合成一种特殊 tRNA 的基因，其产物的反密码子能与（1）中的终止密码子配对结合，并可携带一个非天然氨基酸（Uaa）。将该基因与 载体连接后导入宿主细胞。提取宿主细胞的总RNA进行分子杂交鉴定，筛选获得成功表达上述 tRNA 的转基因宿主细胞。（3）利用转基因宿主细胞制备疫苗。将（1）中的重组质粒导入（2）中的转基因宿主细胞，并在补加非天然氨基酸的培养基中进行培养，则该宿主细胞能利用上述特殊tRNA，翻译出改造病毒基因的完整蛋白，产生大量子代病毒，用于制备疫苗。特殊 tRNA 基因转录时，识别其启动子的酶是D（单选）。A．病毒的 DNA 聚合酶 B．宿主的 DNA 聚合酶C．病毒的 RNA 聚合酶 D．宿主的 RNA 聚合酶（4）上述子代病毒不能在正常宿主细胞中增殖，没有致病性，因此不经灭活或减毒即可制成疫苗。与不具侵染性的流感病毒灭活疫苗相比，该病毒活疫苗的优势之一是可引起细胞免疫，增强免疫保护效果。【专题】41：正推法；548：基因工程．【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用 PCR 技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的 DNA 是否插入目的基因﹣﹣DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了 mRNA﹣﹣分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质﹣﹣抗原﹣抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

题目解答

答案

【解答】解：（1）基因工程中，可以使用 PCR 技术扩增目的基因。将某些基因（不包括表面抗原基因）内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列，导致翻译提前终止，改造后的基因表达时不能合成完整长度的多肽。（2）将目的基因导入受体细胞前，先将目的基因和载体结合构建基因表达载体，确保目的基因可以在受体细胞内稳定存在并表达。提取宿主细胞的总 RNA 进行分子杂交鉴定，筛选获得成功表达上述 tRNA 的转基因宿主细胞。（3）利用转基因宿主细胞制备疫苗。将（1）中的重组质粒导入（2）中的转基因宿主细胞，并在补加非天然氨基酸的培养基中进行培养，则该宿主细胞能利用上述特殊tRNA，基因转录需要专一性的酶的催化，启动子是 RNA 聚合酶识别并结合的位点RNA 聚合酶具有物种专一性，识别其启动子的酶是宿主的 RNA 聚合酶，故选：D。（4）病毒侵入体内后，引起身体产生细胞免疫，增强免疫保护效果。故答案为：（1）PCR 多肽（或蛋白质）（2）载体 总 RNA（3）非天然氨基酸（Uaa） D（4）细胞识解决相关的生物学问题的能力。

解析

考查要点：本题围绕基因工程制备甲型流感病毒活疫苗的过程，考查以下知识点：

  1. PCR技术的应用及基因表达产物的判断；
  2. 基因表达载体的构建要求及分子水平检测方法；
  3. 启动子与RNA聚合酶的识别关系；
  4. 活疫苗与灭活疫苗的免疫机制差异。

解题核心思路：

  • 基因工程基本流程：目的基因获取→构建表达载体→导入受体细胞→检测与鉴定。
  • 关键细节：终止密码子的作用、特殊tRNA的合成、非天然氨基酸的补充、疫苗免疫效果的原理。

第（1）题

关键步骤：

  1. PCR技术用于扩增病毒DNA。
  2. 替换基因片段：将某些基因中的编码氨基酸序列改为终止密码子，导致翻译提前终止，无法合成完整多肽，故病毒无法增殖。

第（2）题

关键步骤：

  1. 构建基因表达载体：需将特殊tRNA基因与载体连接。
  2. 分子杂交检测：提取宿主细胞总RNA，通过探针检测是否成功表达特殊tRNA。

第（3）题

关键分析：

  1. 启动子识别：基因表达载体中的启动子是宿主细胞RNA聚合酶的结合位点。
  2. RNA聚合酶来源：宿主细胞自身的RNA聚合酶识别并结合启动子，驱动tRNA基因转录。

第（4）题

对比分析：

  • 活疫苗：保留完整抗原结构，能引发细胞免疫和体液免疫。
  • 灭活疫苗：病毒被灭活，仅引发体液免疫，免疫保护效果较弱。