题目
何谓PCR？试述PCR技术的基本原理和影响因素。
何谓PCR？试述PCR技术的基本原理和影响因素。
题目解答
答案
P.CR是一种体外酶促扩增特异DNA片段的技术，其原理类似DNA的体内扩增。它包括：PCR包括三个基本过程：①变性（denaturation），即在较高温度（93℃～98℃）使双链模板DNA变性解链成单链DNA，以提供复制的模板；
②退火（annealing），即在较低温度（37℃～65℃）使加入的引物与待扩增DNA区域特异性地结合，以提供DNA复制起始的3′―OH；
③延伸（extension），即在适当的温度（70℃～75℃）下，DNA聚合酶从特异性结合到DNA模板上的引物3′-OH端开始，根据碱基互补配对原则，按照待扩增区域的核苷酸序列，进行DNA链的延伸，即合成新的DNA分子。这三个过程组成一个循环周期；每个周期合成的产物又可作为下一个周期的模板，如此循环往复，经过n轮循环后，靶DNA的拷贝数理论上呈2n增长。
影响PCR反应的因素主要有：引物、TaqDNA聚合酶、dNTP、模板和Mg2+离子，此外，pH、温度、循环次数也会影响PCR反应。
解析
考查要点：本题主要考查对PCR技术的定义、基本原理及影响因素的理解。
解题核心：需明确PCR的三个关键步骤（变性、退火、延伸）及其温度条件，理解指数扩增的原理，同时掌握影响反应效率的五大主要因素（引物、酶、dNTP、模板、Mg²⁺）和环境因素（pH、温度、循环次数）。
破题关键：体外酶促扩增是PCR的核心特点，温度循环控制是实现扩增的关键操作，引物的特异性结合决定扩增的靶向性。
PCR的基本原理
- 变性（Denaturation）
- 温度：93℃～98℃
- 作用：高温使双链DNA解链为单链，提供模板。
- 退火（Annealing）
- 温度：37℃～65℃
- 作用：引物与模板DNA特异性结合，形成3′-OH末端作为复制起点。
- 延伸（Extension）
- 温度：70℃～75℃
- 作用：Taq DNA聚合酶以引物为起点，按碱基互补配对原则合成新链。
- 循环扩增：每轮循环生成的DNA作为下一轮模板，经过n轮后，靶DNA拷贝数呈$2^n$增长。
影响PCR反应的因素
- 引物：需设计特异性序列，浓度和退火温度需匹配。
- Taq DNA聚合酶：耐高温，需保证活性和浓度。
- dNTP：提供合成原料，浓度需适中。
- 模板：纯度和浓度直接影响扩增效率。
- Mg²⁺离子：浓度决定酶活性和引物退火效率。
- 环境因素：pH、温度控制精度、循环次数均会影响结果。